Question

【題目】Rag2基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細胞�？蒲腥藛T利用胚胎干細胞（ES細胞）對Rag2基因缺失小鼠進行基因治療。其技術(shù)流程如圖：

請回答：

（1）該技術(shù)流程所涉及的生物工程技術(shù)有_________________。

①動物細胞培養(yǎng) ②細胞核移植 ③胚胎干細胞的分離與培養(yǎng) ④轉(zhuǎn)基因 ⑤動物細胞融合

（2）在步驟①前，應(yīng)采用______________普遍使用的方法）對卵母細胞進行處理。

（3）ES細胞在功能上的特性是______。在體外培養(yǎng)時，在培養(yǎng)液中添加____，就可以誘導(dǎo)ES細胞向造血干細胞分化。

（4）左圖表示含有Rag2基因的DNA片段，右圖表示pZHZ11質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列�，F(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ4種限制酶識別的堿基序列和切割位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、G↓AATTC、CCC↓GGG。

Rag2基因的獲得可以從鼠的胎盤細胞中提取 ________，通過逆轉(zhuǎn)錄方法合成含Rag2基因的DNA片段。若將Rag2基因和如圖的質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用 _______限制酶切割，而后加入DNA連接酶進行連接。

（5）步驟③中，需要構(gòu)建含有Rag2基因的表達載體�？梢愿鶕�(jù)_____________設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)擴增Rag2基因片段。

（6）為檢測Rag2基因的表達情況，可提取治療后小鼠骨髓細胞中的___________，用抗Rag2蛋白的抗體進行雜交實驗。

Answer 1

【答案】①②③④ 顯微操作去核法 有發(fā)育的全能性 分化誘導(dǎo)因子 mRNA BamHⅠ Rag2基因 蛋白質(zhì)

【解析】

分析題圖：圖示是利用胚胎干細胞（ES細胞）對Rag2基因缺失小鼠進行基因治療的過程圖解，其中①表示核移植過程，②表示早期胚胎培養(yǎng)過程，③表示采用基因工程技術(shù)將目的基因?qū)�入受體細胞。

（1）該技術(shù)流程所涉及的生物工程技術(shù)有動物細胞培養(yǎng)、細胞核移植、胚胎干細胞的分離與培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因。

（2）核移植是將體細胞核移植到去核的卵母細胞中，所以實驗前要去除卵母細胞的細胞核，常用方法為顯微操作去核法。

（3）ES細胞來源于早期胚胎或者原始性腺，它在形態(tài)上的特性是體積小、細胞核大、核仁明顯；在功能上的特性是具有發(fā)育的全能性，即可以分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。在體外培養(yǎng)時，在培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)因子，如牛黃酸等化學(xué)物質(zhì)時，就可誘導(dǎo)ES細胞向不同組織分化。

（4）要通過轉(zhuǎn)錄方法合成含Rag2基因的DNA片段，必須以Rag2基因轉(zhuǎn)錄的mRNA為模板，因此可以從鼠的胎盤細胞中提取Rag2基因的mRNA。能夠獲取目的基因并切開質(zhì)粒的限制酶有識別序列為GGATCC，只有BamHⅠ的識別序列為GGATCC，因此選用BamHⅠ限制酶切割，而后加入DNA酶連接。

（5）將目的基因?qū)�入受體細胞時，需要先構(gòu)建含有Rag2基因的表達載體（重組質(zhì)粒）�？梢愿鶕�(jù)Rag2基因的核苷酸序列設(shè)計合成引物，利用PCR技術(shù)擴增Rag2基因片段。

（6）為檢測Rag2基因的表達情況，可采用抗原-抗體雜交法，即提取治療后的小鼠骨髓細胞的蛋白質(zhì)（抗原），用抗Rag2 蛋白的抗體進行雜交實驗。