Question

【題目】細(xì)胞內(nèi)具有多種miRNA對(duì)基因表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用，研究人員利用基因編輯技術(shù)建立miRNA-301a（某種miRNA）基因敲除的小鼠模型，用于研究miRNA-301a的調(diào)節(jié)功能。請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題：

（1）下圖為miRNA形成和發(fā)揮作用的過(guò)程簡(jiǎn)圖，據(jù)圖可知miRNA基因通過(guò)___________形成前體miRNA，然后經(jīng)過(guò)________過(guò)程形成miRNA，miRNA通過(guò)________調(diào)控翻譯過(guò)程。

（2）構(gòu)建miRNA基因敲除的小鼠。其作用機(jī)制如下圖所示。

注：gRNA與Cas9蛋白結(jié)合后可以切割DNA

①取miRNA基因：根據(jù)miRNA基因序列設(shè)計(jì)并合成______________________，然后通過(guò)_________技術(shù)擴(kuò)增得到miRNA基因。同理構(gòu)建gRNA的模板DNA。

②構(gòu)建基因表達(dá)載體：利用________________________酶構(gòu)建如下圖所示的基因表達(dá)載體。

③通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得miRNA-gRNA，再將miRNA-gRNA與Cas9混合后采用顯微注射技術(shù)注入小鼠__________________中。

（3）經(jīng)上述操作獲得的8只小鼠稱為F0代。

①經(jīng)過(guò)限制酶Ⅰ剪切后電泳檢測(cè)小鼠miRNA基因敲除情況如下圖所示。

F0代小鼠檢測(cè)其中5號(hào)為野生型，M為標(biāo)準(zhǔn)物）F0代中_____________號(hào)為基因敲除小鼠，經(jīng)過(guò)基因測(cè)序后選擇_____________與敲除堿基對(duì)數(shù)目最多的4號(hào)小鼠雜交，產(chǎn)生F1代小鼠。

②用限制酶Ⅱ剪切后電泳檢測(cè)F1代小鼠如圖1所示。

從F1中選出4號(hào)和5號(hào)個(gè)體雜交產(chǎn)生F2代小鼠，然后用同種方法檢測(cè)F2代小鼠結(jié)果如上圖2所示，最終確定F2代中________號(hào)小鼠為miRNA基因敲除純合子小鼠。

Answer 1

【答案】轉(zhuǎn)錄 剪切、酶切、解旋（剪切、酶切過(guò)程必須有） 與mRNA結(jié)合阻止核糖體移動(dòng) 引物 PCR 限制酶和DNA連接酶 受精卵 1234678號(hào) 野生型（或5號(hào)） Ⅱ-1號(hào)和Ⅱ-5號(hào)

【解析】

1、轉(zhuǎn)錄過(guò)程以四種核糖核苷酸為原料，以DNA分子的一條鏈為模板，在DNA解旋酶、RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA。

2、翻譯過(guò)程以氨基酸為原料，以轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)生的mRNA為模板，在酶的作用下，消耗能量產(chǎn)生多肽鏈，多肽鏈經(jīng)過(guò)折疊加工后形成具有特定功能的蛋白質(zhì)。

3、基因工程的操作步驟：目的基因的獲�。ɑ�因文庫(kù)獲取、PCR、人工合成）；構(gòu)建基因表達(dá)載體（含目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)）；把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、鈣離子處理法）；目的基因的檢測(cè)和鑒定（分子水平—DNA分子雜交法、分子雜交法、抗原抗體雜交法和個(gè)體水平—抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)等）。

(1)根據(jù)miRNA形成和發(fā)揮作用的過(guò)程圖可知,miRNA基因首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成前體miRNA,前體rniRNA接著經(jīng)過(guò)剪切、酶切、解旋過(guò)程形成成熟的miRNA;miRNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后,形成miRNA -蛋白復(fù)合物,該復(fù)合物通過(guò)與mRNA結(jié)合后阻止核糖體在mRNA.上的移動(dòng)，阻止了翻譯過(guò)程的繼續(xù)進(jìn)行。

(2)構(gòu)建miRNA基因敲除的小鼠要經(jīng)歷3個(gè)步驟。

①獲取miRNA基因:根據(jù)miRNA基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,然后通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到miRNA基因。同埋構(gòu)建gRNA的模板DNA。

②構(gòu)建基因表達(dá)載體:利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶這兩種工具酶構(gòu)建基因表達(dá)載體,獲得同時(shí)含有miRNA和gRNA的基因片段。

③通過(guò)獲得的含有miRNA和gRNA的基因片段,在體外轉(zhuǎn)錄獲得miRNA-gRNA(一種mRNA;再將miRNA-gRNA與Cas9蛋白混合后,采用顯微注射技術(shù)注人小鼠受精卵中。miRNA-gRNA中的miRNA就可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)和DNA中的miRNA基因結(jié)合起來(lái),將gRNA和Cas9蛋白定向地引導(dǎo)到miRNA基因所在的位置，gRNA和Cas9蛋白將miRNA基因從一個(gè)DNA上切除,這樣受精卵就出現(xiàn)了缺乏miRNA基因的DNA,受精卵發(fā)育形成的小鼠體細(xì)胞中也會(huì)出現(xiàn)不含有miRNA基因的DNA。

(3)①由于小鼠體細(xì)胞的同源染色體成對(duì)存在,因此同源染色體上的DNA也是成對(duì)存在的。5號(hào)野生型小鼠染色體上的兩個(gè)含有miRNA基因的DNA都是正常的，基因型假設(shè)為AA,經(jīng)過(guò)限制酶I剪切后，只產(chǎn)生750 bp的DNA片 段。缺乏miRNA基因的一個(gè)DNA被酶切割后，產(chǎn)生的是500 bp的片段。因此,F0中1、2、3、4、6、7、8號(hào)均為基因敲除小鼠;經(jīng)過(guò)基因測(cè)序后選擇野生型(5號(hào))與敵除堿基對(duì)數(shù)目最多的4號(hào)小鼠雜交產(chǎn)生F小鼠。

②用限制酶II剪切后電泳檢測(cè)Ft小鼠,4號(hào)和5號(hào)個(gè)體都含有750 bp和500 bp的片段。它們雜交后產(chǎn)生F2小鼠, II1號(hào)和II5號(hào)只含有500 bp的片段,它們只含有缺乏miRNA的DNA,是miRNA基因敲除的純合子。