Question

【題目】實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)稱qPCR，靈敏度高特異性好，是目前檢測(cè)微小殘留病變的常用方法。將標(biāo)有熒光素的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測(cè)樣本DNA配對(duì)結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光（如下圖所示），隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值（該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)）。

（1）做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成__________。除此之外，qPCR的反應(yīng)體系還需要加入___________、_________和___________。

（2）在反應(yīng)過(guò)程中，___________為新鏈的合成提供能量。

（3）醫(yī)務(wù)人員對(duì)三位慢性粒細(xì)胞白血病患者（由B基因過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致）進(jìn)行治療后，想檢測(cè)治療效果，利用上述技術(shù)寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路和簡(jiǎn)要結(jié)果分析。

實(shí)驗(yàn)思路：__________________簡(jiǎn)要結(jié)果_____________________________

Answer 1

【答案】引物和Taqman探針 待測(cè)樣本（模板DNA） dNTP 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶） dNTP 三位患者分別編號(hào)甲、乙、丙，分別抽取適量血樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)B基因的序列設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度 三位患者檢測(cè)的Ct值越小，說(shuō)明治療效果越好，反之，治療效果越差

【解析】

PCR技術(shù)：

1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

2、原理：DNA復(fù)制。

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物。

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

5、過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

（1）PCR需要根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成引物，同時(shí)qPCR還需要Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合，所以還需要合成Taqman探針；在反應(yīng)體系中還需要添加待測(cè)樣本（模板DNA）、dNTP、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）。

（2）在反應(yīng)過(guò)程中，dNTP為新鏈的合成提供能量。

（3）根據(jù)題干信息“將標(biāo)有熒光素的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測(cè)樣本DNA配對(duì)結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值（該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān)）”；

所以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)思路：三位患者分別編號(hào)甲、乙、丙，分別抽取適量血樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)B基因的序列設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度；

結(jié)果：Ct值越小，說(shuō)明治療效果越好，反之，治療效果越差。