Question

【題目】透明質酸酶是一種能夠降低體內透明質酸的活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶。下圖是利用重疊延伸PCR技術獲得新透明質酸酶基因的過程，NcoI和XhoI為限制酶識別位點。請分析回答下列問題：

（1）圖中新透明質酸酶基因的獲得是重疊延伸PCR技術在__________(基因敲除／基因的定點突變／融合基因的構建)方面的應用。透明質酸酶基因上的一段核苷酸序列為“-ATCTCGAGCGGG-”，則對該段核苷酸序列進行剪切的XhoI酶識別的核昔酸序列(6個核苷酸)為___________________。

（2）構建透明質酸酶基因表達載體時，使用的載體往往有特殊的標記基因，其作用是_________________；所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列________(有／沒有)專一性要求。早期利用大腸桿菌作為受體細胞，后來發(fā)現毛霉或酵母菌更具優(yōu)勢，最可能的原因是_________________________。

（3）人體細胞間質有基膜粘連蛋白、多糖(如透明質酸)、蛋白多糖等成分。動物細胞培養(yǎng)時將取出的組織塊分散成單個細胞的做法為____________________。鏈球菌等致病菌在侵染人體時，可產生透明質酸酶，試分析透明質酸酶在鏈球菌侵染過程中的作用是______________，其意義可能是____________________________________

Answer 1

【答案】基因的定點突變 -CTCGAG- 或 -GAGCTC- 供重組DNA的鑒定和選擇 沒有 (毛霉酵母菌)是真核細胞，有內質網和高爾基體加工 剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時間 分解宿主細胞間質的主要成分（或分解宿主細胞間質的透明質酸） 破壞宿主的防御系統(tǒng)，利于致病菌入侵(或為細菌提供能源物質)

【解析】

1、PCR過程有三個步驟：目的基因DNA受熱變性后解旋為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，在DNA聚合酶作用下延伸。

2、基因工程一般要經歷四個步驟：提取目的基因、目的基因與運載體結合、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。

3、動物細胞培養(yǎng)的過程：取動物組織塊——剪碎組織——用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞——制成細胞懸液——轉入培養(yǎng)液中（原代培養(yǎng)）——放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)——貼滿瓶壁的細胞用酶分散為單個細胞制成細胞懸液——轉入培養(yǎng)液（傳代培養(yǎng)）——二氧化碳培養(yǎng)箱。

（1）重疊延伸PCR技術是一種基因的定點突變技術。限制性核酸內切酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。XhoI限制酶識別的序列及位點是5，-CTCGAG-3，中的C、T位點。所以若透明質酸酶基因上的一段核苷酸序列為“-ATCTCGAGCGGG-”，則對該段核苷酸序列進行剪切的XhoI酶識別的核昔酸序列為-CTCGAG- 或 -GAGCTC- 。

（2）表達載體的構建一般含有特殊的標記基因，其含有的標記基因的作用是便于重組DNA的鑒定和選擇。DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來，所連接的DNA兩端堿基序列沒有專一性要求。用毛霉或酵母菌替代大腸桿菌作為受體更具有優(yōu)勢，是因為毛霉和酵母菌為真核生物，有對目的基因表達產物進行加工的內質網和高爾基體，產生的透明質酸酶是具有生物活性的。

（3）動物細胞培養(yǎng)時先取出動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織），再剪碎，再用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時間使其分散成單個細胞。鏈球菌等致病菌在侵染人體時，可產生多種酶，如透明質酸酶等，能溶解細胞間質的透明質酸、纖維蛋白和其他蛋白質，破壞纖維所形成的膿腫壁，這樣能破壞宿主的防御系統(tǒng)，利于致病菌入侵。