Question

【題目】基因工程的第一步是篩選獲取目的基因，利用PCR技術(shù)獲取目的基因是一種常用的手段。圖示某DNA分子經(jīng)切后，DNA片段自身環(huán)化并利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的部分過程。

（1）PCR與生物體內(nèi)DNA復(fù)制過程不同，解旋時(shí)不需要_______________酶催化而是通過_______________實(shí)現(xiàn)的，因此PCR技術(shù)使用的DNA聚合酶必須是_______________的。

（2）如果在某基因組中定位了一個(gè)目的基因X，其堿基序列未知，但已知X臨近區(qū)域的一段DNA序列，此時(shí)可利用圖示方法進(jìn)行目的基因的篩選和擴(kuò)增。作用于圖示多個(gè)酶切點(diǎn)的限制酶種類應(yīng)_______________（相同/不同）。操作時(shí)根據(jù)圖中的_______________設(shè)計(jì)引物，將含有目的基因的DNA片段克隆出來(lái)，為便于目的基因與載體結(jié)合，可在_______________添加特定的限制酶識(shí)別序列。

（3）實(shí)踐中也常用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，這種技術(shù)是以RNA為模板。若利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因，應(yīng)選擇_______________細(xì)胞提取RNA。

Answer 1

【答案】解旋酶 90～95℃高溫處理 耐高溫（耐熱或熱穩(wěn)定） 相同 已知序列 兩條引物 胰島B細(xì)胞

【解析】

PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。其原理是DNA復(fù)制，需要模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），以指數(shù)的方式擴(kuò)增，即約2n。引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)。

（1）PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR中先用90～95℃高溫處理的目的是使DNA變性（使DNA的兩條鏈解開），而這一過程中在細(xì)胞內(nèi)是通過解旋酶的催化實(shí)現(xiàn)的。所以PCR技術(shù)解旋不需要解旋酶，通過90～95℃高溫處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。PCR反應(yīng)包含多次循環(huán)，每次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸，PCR技術(shù)在較高溫度下進(jìn)行，因此需要耐高溫（耐熱或熱穩(wěn)定）的DNA聚合酶。

（2）根據(jù)圖示，用PCR技術(shù)擴(kuò)增X基因時(shí)，酶切后有自身環(huán)化現(xiàn)象，說(shuō)明酶切后形成的末端堿基序列相同，所以作用于圖示多個(gè)酶切點(diǎn)的限制酶種類應(yīng)該相同。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。題中目的基因X堿基序列未知，X臨近區(qū)域的一段DNA序列已知。操作時(shí)需要根據(jù)圖中已知序列的一段DNA序列設(shè)計(jì)引物。為了便于擴(kuò)增后的X基因與質(zhì)粒連接，常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入特定的限制酶識(shí)別序列，主要目的是使X基因能定向插入表達(dá)載體。

（3）RT-PCR是以mRNA作為模板擴(kuò)增得到DNA的技術(shù)，若利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因，需要在胰島B細(xì)胞中提取mRNA，因?yàn)橐葝u素基因只在胰島B細(xì)胞中表達(dá)。