Question

【題目】如圖所示為A、B、C三種質粒和一個含目的基因D的DNA片段示意圖。圖1中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍色顯色基因。圖中EcoRⅠ、PvuⅠ為兩種限制酶，質粒上限制酶括號內的數(shù)字表示限制酶切割位點與復制原點的距離�；卮鹣铝袉栴}：

（1）圖中三種質粒中不能作為目的基因運載體的是______，理由是______、______。

（2）在基因工程的操作過程中，需要檢查目的基因是否重組到質粒中，應使用______酶切重組質粒，完全酶切后，進行電泳檢測。若電泳圖譜中出現(xiàn)長度為1.1kb和5.6kb，或者______kb和______kb的片段，則可判斷該重組質粒已與目的基因重組成功。

（3）為研究目的基因D的功能，研究人員用圖2所示的引物組合分別擴增D基因的D1片段、D3片段（DNA復制子鏈的延伸方向5′→3′）。

注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段分別與N基因兩端互補配對

①用引物Ⅰ、Ⅱ組合擴增后，得到的絕大部分DNA片段是圖3中的______。

②將大量N基因片段與擴增得到的D1片段、D3片段置于PCR反應體系中進行擴增，得到的絕大多數(shù)擴增產(chǎn)物是______（填“D1-N”或“D1-D3-N”或“D3-N”或“D1-N-D3”）。

Answer 1

【答案】質粒A、質粒C（質粒A）缺少標記基因（質粒C）復制原點會被限制酶切割EcoRⅠ3.13.6dD1-N-D3

【解析】

本題以圖文結合為情境綜合考查學生對基因工程的基本操作程序，特別是利用PCR技術擴增目的基因以及基因表達載體的構建等相關知識的識記和理解能力，以及分析問題的能力。

(1)分析圖1可知：目的基因D的兩端均存在限制酶PvuⅠ的識別位點，而EcoRⅠ的識別位點則在目的基因D的內部，因此在構建重組質粒時，應選用PvuⅠ切割含有目的基因D的DNA片段，以保證目的基因D的結構完整。據(jù)此分析A、B、C三種質粒的結構可知：質粒A缺少標記基因，質粒C在用和目的基因相同的限制酶PvuⅠ切割時，復制原點會被限制酶切割，進而影響重組質粒的自主復制，所以質粒A、質粒C均不能作為目的基因的運載體。

(2)依題意和分析圖1可知：由于目的基因D的長度為4.0kb，因此用質粒B構建的重組質粒的長度為4.0kb＋2.7kb＝6.7kb。在檢查目的基因是否重組到質粒中的操作過程中，重組質粒被某種限制酶完全酶切后，電泳檢測的結果出現(xiàn)了1.1kb的片段，說明使用的限制酶不可能是PvuⅠ（用PvuⅠ切割不能得到1.1kb的片段），而是EcoRⅠ。用質粒B構建重組質粒時，若目的基因D正向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離最近），則用EcoRⅠ酶切時，會得到0.1＋1.0＝1.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－1.0）＝5.6（kb）的兩個片段；用質粒B構建重組質粒時，若目的基因D反向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離較遠），則用EcoRⅠ酶切時，會得到0.1＋3.0＝3.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－3.0）＝3.6（kb）的兩個片段。

(3) 分析圖2可知：①用引物Ⅰ、Ⅱ組合擴增的是D1片段，以引物Ⅱ所在的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA時，引物Ⅱ上的x片段也被作為模板合成子鏈，因此得到的絕大部分DNA片段是圖3中的d。②由于引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段都能與N基因兩條鏈上的堿基進行互補配對，因此將大量N基因片段與擴增得到的D1片段、D3片段置于PCR反應體系中進行擴增，得到的絕大多數(shù)擴增產(chǎn)物是D1-N-D3。