Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領(lǐng)域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是____�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了__________和___________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是_________。

A．Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個切割位點

B．目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，每種限制酶只有一個切割位點

C．酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達載體中未標注出的必需元件還有___________，步驟③中需先用______處理農(nóng)桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是___________。

（4）用煙草花葉病毒對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和普通煙草進行接種實驗，接種后第19天對照組植株進入病情指數(shù)（植物受病毒侵染的嚴重程度）為100的平臺期，而轉(zhuǎn)基因植株在第______天才進入平臺期，但此時的病情指數(shù)為79。說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有__________。

Answer 1

【答案】 雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC AC 復制原點 Ca2+ 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或?qū)�入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄 22 實驗得到的干擾素表達量較低，未能很好啟動機體產(chǎn)生抗性；或：病毒接種量過大，相對來說干擾素誘導調(diào)控作用滯后；或：植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導致外源基因表達的干擾素誘導或調(diào)控作用減弱

【解析】試題分析：分析圖解，圖中過程①表示獲取目的基因，過程②表示基因表達載體的構(gòu)建，過程③表示將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌，過程④表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，因此科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達載體需用兩種限制酶，Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個切割位點，A正確；目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，不能有限制酶的切割位點，B錯誤；酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同，否則會自我環(huán)化，C正確；酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列應(yīng)該不同，否則會自我連接，D錯誤。

（2）基因表達載體必需具備的成分有目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復制原點，圖中還缺復制原點；微生物細胞作為受體細胞時，需要鈣離子處理使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞，因此過程③中需先用Ca2+（或CaCl2）處理農(nóng)桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）提取的愈傷組織細胞的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄過程得到DNA；最終未能檢測出干擾素基因，可能是因為雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或?qū)�入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄。

（4）據(jù)圖分析，接種后第19天對照組植株進入病情指數(shù)為100的平臺期，而轉(zhuǎn)基因植株在第22天才進入平臺期，且此時的病情指數(shù)為79，說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能是因為實驗得到的干擾素表達量較低，未能很好啟動機體產(chǎn)生抗性（或病毒接種量過大，相對來說干擾素誘導調(diào)控作用滯后；或植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導致外源基因表達的干擾素誘導或調(diào)控作用減弱）。