Question

【題目】Cre/loxP重組酶系統(tǒng)是對(duì)轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞DNA上的特定序列進(jìn)行定點(diǎn)切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對(duì)生物基因進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)。其原理是重組酶Cre能識(shí)別loxP位點(diǎn)（特定的DNA序列），并使loxP位點(diǎn)間的基因序列被重組或刪除。受此啟發(fā)，科學(xué)家在檢測(cè)抗蟲基因成功導(dǎo)入煙草細(xì)胞后，嘗試用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)的抗除草劑基因，其技術(shù)過程如圖2（其中■表示啟動(dòng)子）。

（1）通過基因改造獲得抗蟲煙草過程中，為大量獲得抗蟲基因，可選擇圖1中引物___________（用圖中羅馬數(shù)字表示）組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增時(shí)，為確�？瓜x基因和表達(dá)載體充分連接，常在基因上、下游引物的___________端添加不同的限制酶切位點(diǎn)，其目的是______________________。

（2）loxP是一種含34個(gè)堿基對(duì)的小型DNA片段，由一個(gè)不對(duì)稱的間隔區(qū)和兩個(gè)反向重復(fù)序列組成。Cre酶能特異性地識(shí)別反向重復(fù)序列并于特定位置切開磷酸二酯鍵，類似于基因工程中的___________酶，從遺傳學(xué)角度分析，Cre酶改變質(zhì)粒的原理是____________。

（3）通常用___________法把攜帶抗蟲基因的重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入煙草細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)導(dǎo)入成功后，抗除草劑基因即失去用途，繼續(xù)留在煙草體內(nèi)可能會(huì)引發(fā)的生物環(huán)境安全問題是_______________________。

（4）經(jīng)Cre酶處理后，質(zhì)粒中的兩個(gè)loxP序列分別被切開，得到圖2右側(cè)的兩個(gè)環(huán)狀DNA分子。由于______________________，抗除草劑基因不再表達(dá)，之后會(huì)在培養(yǎng)過程中消失。

Answer 1

【答案】Ⅱ、Ⅲ 5' 減少DNA自連，使抗蟲基因能定向插入表達(dá)載體 限制（酶） 基因重組 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（法） 抗除草劑基因可能轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染 質(zhì)粒乙的抗除草劑基因前沒有啟動(dòng)子

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲��；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣；

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：可分為分子水平的檢測(cè)與個(gè)體水平的檢測(cè)。

（1）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因過程中，引物與模板鏈的3′端結(jié)合，子鏈從5′端開始延伸，故要擴(kuò)增抗蟲基因應(yīng)選擇圖1中引物Ⅱ、Ⅲ；為保證抗蟲基因和表達(dá)載體的充分連接，PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)在基因上、下游引物的5′端分別添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制酶酶切位點(diǎn)，主要目的是使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。

（2）Cre酶能特異性地識(shí)別反向重復(fù)序列并在特定位置切開磷酸二酯鍵，其功能類似于基因工程中的限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）；從遺傳學(xué)角度分析，Cre酶改變質(zhì)粒相當(dāng)于實(shí)現(xiàn)了基因間的重組，原理是基因重組。

（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞的常用方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；抗除草劑基因?qū)儆谕庠椿�因，若繼續(xù)留在煙草體內(nèi)可能會(huì)轉(zhuǎn)移到雜草中，造成基因污染。

（4）啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)露出mRNA，最終合成所需蛋白質(zhì)。據(jù)圖可知，質(zhì)粒乙的抗除草劑基因前沒有啟動(dòng)子（其中■表示啟動(dòng)子），故抗除草劑基因不再表達(dá)，之后會(huì)在培養(yǎng)過程中消失。