Question

10．大腸桿菌pUC18質(zhì)粒是基因工程中常用的運(yùn)載體．某限制酶在此質(zhì)粒上的唯一酶切位點(diǎn)位于LacZ基因中，如果沒有插入外源基因，LacZ基因便可表達(dá)出β-半乳糖苷酶．當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落，反之，則形成白色菌落．如圖表示利用此質(zhì)粒實(shí)施基因工程的主要流程．

請(qǐng)分析并回答：
（1）已獲得的目的基因可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增．
（2）目的基因插入質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中，需要DNA連接酶恢復(fù)磷酸二酯鍵．
（3）將試管Ⅰ中的物質(zhì)和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是進(jìn)行轉(zhuǎn)化；大腸桿菌需事先用Ca²⁺進(jìn)行處理，目的是使大腸桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)．
（4）將試管Ⅱ中的菌液接種于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中應(yīng)含有大腸桿菌必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、無機(jī)鹽、水和生長(zhǎng)因子，還應(yīng)加入IPTG、X-gal以及氨芐青霉素，其中加入氨芐青霉素的作用是篩選出導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌．
（5）若觀察到培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色菌落，則說明大腸桿菌中已成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒．如果作為受體細(xì)胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則不利于重組質(zhì)粒的篩選，原因是無論大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒，均會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色菌落．

Answer 1

分析 分析題圖：大腸桿菌pUC18質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因和LacZ基因，但限制酶的切割位點(diǎn)位于LacZ基因上，所以構(gòu)建成的重組質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因，但LacZ基因被破壞，不能產(chǎn)生β一半乳糖苷酶．試管Ⅰ中是基因表達(dá)載體，試管Ⅱ中是大腸桿菌，將試管I中的物質(zhì)和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．

解答 解：（1）PCR技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，所以已獲得的目的基因可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增．
（2）DNA連接酶連接形成的是磷酸二酯鍵．
（3）將試管I中的物質(zhì)和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是使目的基因進(jìn)人受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)，即進(jìn)行轉(zhuǎn)化；大腸桿菌需事先用Ca²⁺進(jìn)行處理，增大細(xì)胞壁的通透性，使之處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)．
（4）培養(yǎng)基中應(yīng)含有大腸桿菌必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、水和生長(zhǎng)因子．由于質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌能抗氨芐青霉素，所以培養(yǎng)基中還應(yīng)加入氨芐青霉素，作用是篩選出導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌．此外培養(yǎng)基中還應(yīng)加入IPTG、X-gal．
（5）重組質(zhì)粒上的LacZ基因被破壞，不能產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，若大腸桿菌中已成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，則其在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基中形成白色菌落．如果作為受體細(xì)胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則無論大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒，均會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，這樣不利于重組質(zhì)粒的篩選．
故答案為：
（1）PCR
（2）磷酸二酯
（3）進(jìn)行轉(zhuǎn)化      使大腸桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)
（4）導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌
（5）白      無論大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒，均會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色菌落

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合流程圖，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的具體操作步驟及相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合題中和圖中信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱識(shí)記和理解層次的考查．