Question

14．將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)�入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力．以下是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖．

表一引物對(duì)序列表

引物對(duì)A	P1　 AACTGAAATGTAGCTATC
	P2　 TTAAGTCCATTACTCTAG
引物對(duì)B	S1　 GTCCGACTAGTGGCTCTC
	S2　 AGCTGGCGTTTAGCCTCC

表二：幾種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)表

限制酶	Alu	EcoRI	PstI	SmaI
切割位點(diǎn)	AG↓CT	G↓AATC	CTGCA↓G	CCC↓CCC
	TC↑GA	CTTAA↑G	G↑ACGTC	GGG↑CCC

請(qǐng)根據(jù)以上圖表回答下列問題．
（1）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是耐高溫．
（2）PCR過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定．表1根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖2為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖．請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度？引物對(duì)B．
（3）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟6轉(zhuǎn)基因所用的細(xì)菌B通常為農(nóng)桿菌，鑒定目的基因是否整合到細(xì)胞染色體上的方法是DNA分子雜交技術(shù)．
（4）構(gòu)建符合要求的重組質(zhì)粒T時(shí)需要用到的酶是限制酶和DNA連接酶酶，重 組質(zhì)粒T時(shí)需要具備目的基因、復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因，標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因
（5）符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切，假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開，請(qǐng)根據(jù)圖1中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表2所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷．
①采用EcoRI和PstI酶切，得到2種DNA片斷．
②采用EcoRI和SmaI酶切，得到1種DNA片段．

Answer 1

分析 1、PCR技術(shù)是在體外對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所用的DNA聚合酶與體內(nèi)DNA聚合酶不同，是耐高溫的DNA聚合酶，過程為變性使DNA分子兩條鏈解旋開來，復(fù)性是讓引物與DNA解旋開來的單鏈互補(bǔ)配對(duì)，延伸是在DNA聚合酶的作用在引物引導(dǎo)下合成子代DNA分子．
2、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
3、耐高溫的DNA分子中通常含有G與C堿基比例大，因?yàn)樗鼈冎�間有三個(gè)氫鍵，而A與T之間只有兩個(gè)氫鍵．

解答 解：（1）PCR方法擴(kuò)增目的基因的過程中，需要進(jìn)行高溫解旋過程，因此使用的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性．
（2）由于A和T之間有2個(gè)氫鍵，而C和G之間有3個(gè)氫鍵，因此C和G的含量越高，DNA分子越穩(wěn)定．引物B中含C與G的堿基對(duì)較多，可采用較高的退火溫度．
（3）植物基因工程中，將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，因此受體菌B通常為農(nóng)桿菌．檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞常用DNA分子雜交技術(shù)．
（4）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，首先要用限制酶切割目=外源DNA分子和運(yùn)載體，其次需要用DNA連接酶將目的基因與運(yùn)載體連接形成重組DNA；基因表達(dá)載體的組成包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等，其中標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因．
（5）用EcoR I酶和Alu I酶切割抗原DNA片段產(chǎn)生了X、Y兩個(gè)片段，而用EcoR I酶和SmaI酶切割質(zhì)粒產(chǎn)生了 M、N兩個(gè)片段，且M、N片段間存在Pst I酶切點(diǎn)．因此再用EcoRⅠ和PstⅠ酶切割這兩片段形成的重組質(zhì)粒，由于保留了Pstl的切割位點(diǎn)，所以可以得到兩種DNA分子，而用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切重組質(zhì)粒中，如圖1-②過程只能產(chǎn)生一種DNA片斷．
故答案為：
（1）耐高溫
（2）引物對(duì)B
（3）農(nóng)桿菌   DNA分子雜交技術(shù)
（4）限制酶   DNA連接酶   啟動(dòng)子   鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因
（5）2   1

點(diǎn)評(píng) 本題具有一定的難度，考查了運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因的有關(guān)知識(shí)，意在考查考生的圖解識(shí)別能力，尤其是限制酶的作用是解答本題的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)；能夠識(shí)記PCR技術(shù)中DNA聚合酶耐高溫的特點(diǎn)；識(shí)記DNA分子中C-G堿基對(duì)穩(wěn)定強(qiáng)．