Question

【題目】科研人員培育了一種能夠降解餐廚廢棄物并生成乳酸的轉(zhuǎn)基因畢赤酵母。基本思路是在乳酸脫氫酶基因（LDH）的單基因表達載體中逐個接入糖化酶基因（Ga）表達盒與α-淀粉酶基因（Amy）表達盒，構建出AGL-三基因表達載體，如圖1所示：（ori為復制原點；ZeocinR為博來霉素抗性基因；）LDH-單基因表達載體①②GL-二基因表達載體AGL-三基因表達載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達檢測。

（1）獲取目的基因：利用PCR技術獲得目的基因的過程中，需要在PCR反應體系中加入模板、Taq酶及______。

（2）將圖1所示結構“導入”畢赤酵母后，要篩選出含有三基因表達載體的畢赤酵母的操作思路是：______。

（3）對篩選出的菌株進行進一步鑒定的方法有：______（寫出一種）。利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母降解餐廚廢棄物生成乳酸，既減少了環(huán)境污染，也降低了乳酸的生產(chǎn)成本，這符合生態(tài)工程中的______原理。

（4）構建三基因表達載體的難點在于構建目的基因的表達盒，圖2LDH-單基因表達載體①②GL-二基因表達載體AGL-三基因表達載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達檢測為構建α-淀粉酶基因表達盒的示意圖（糖化酶基因表達盒構建與之類似，此處省略）。

注：pro為啟動子；AOXTT為終止子；Bsp119Ⅰ、XbaⅠ、BglII、BamHⅠ為四種限制酶）LDH-單基因表達載體①②GL-二基因表達載體AGL-三基因表達載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達檢測

操作的處理是：將質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ與XbaⅠ兩種不同的限制酶處理，然后拼接。與用一種限制酶切相比，優(yōu)點是______；在此之前，科研人員還利用點突變技術對α-淀粉酶基因序列進行了同義密碼子替換（即不影響氨基酸序列）改造，推測其原因______。操作中必需用______酶對質(zhì)粒2處理，才能獲得能正常表達的α-淀粉酶基因表達盒。

Answer 1

【答案】引物和四種游離的脫氧核苷酸 將畢赤酵母轉(zhuǎn)移至含博來霉素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選出能夠生存的菌落即為含有三基因表達載體的畢赤酵母 測定其基因表達產(chǎn)物（酶）的活性；將其接種至餐廚廢棄物中，定時測定乳酸的含量 整體性 防止目的基因、質(zhì)粒1發(fā)生自身環(huán)化；使質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因以正確的方向進行拼接 α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的識別序列 BglII、BamHⅠ

【解析】

基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）利用PCR技術獲得目的基因的過程中，需要在PCR反應體系中加入模板、Taq酶及引物和四種游離的脫氧核苷酸。

（2）篩選出含有三基因表達載體的畢赤酵母的操作思路是將畢赤酵母轉(zhuǎn)移至含博來霉素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選出能夠生存的菌落即為含有三基因表達載體的畢赤酵母。

（3）對篩選出的菌株進行進一步鑒定的方法有測定其基因表達產(chǎn)物（酶）的活性；將其接種至餐廚廢棄物中，定時測定乳酸的含量。利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母降解餐廚廢棄物生成乳酸，既減少了環(huán)境污染，也降低了乳酸的生產(chǎn)成本，這符合生態(tài)工程中的整體性原理。

（4）將質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ與XbaⅠ兩種不同的限制酶處理，然后拼接。與用一種限制酶切相比，優(yōu)點是防止目的基因、質(zhì)粒1發(fā)生自身環(huán)化；使質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因以正確的方向進行拼接；在此之前，科研人員還利用點突變技術對α-淀粉酶基因序列進行了同義密碼子替換（即不影響氨基酸序列）改造，推測其原因α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的識別序列。操作中必需用BglII、BamHⅠ酶對質(zhì)粒2處理，才能獲得能正常表達的α-淀粉酶基因表達盒。