Question

14．白細(xì)胞介素-1（IL-1）是重要的炎性介質(zhì)之一，也是一種熱原質(zhì)成分，具有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用．它主要在細(xì)胞免疫激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用．某項(xiàng)目小組利用基因工程技術(shù)大量合成IL-1，在pBV220載體（圖A）多克隆位點(diǎn)的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間插入目的基因IL1-His，構(gòu)建表達(dá)載體pBV-IL1-His（圖B）．轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌），通過選擇性培養(yǎng)基（Amp^r）和菌體PCR法篩選重組子陽性克�。�在適宜條件下培養(yǎng)并誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，最后利用His抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測表達(dá)情況．
（1）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和pBV220載體在酶切后的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ．目的基因的長度為487pb（重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)之間的堿基對忽略不計(jì)）．pBV-IL1-His表達(dá)載體除了氨芐青霉素抗性基因（Amp^r）、目的基因外還必須具有啟動子、終止子等基因．
（2）轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌時(shí)需要用Ca²⁺處理細(xì)胞．利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA時(shí)，需將雙鏈DNA加熱到90℃以上，目的是使雙鏈DNA變性，解聚為單鏈．
（3）最后是通過抗原-抗體雜交技術(shù)來檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是否成功．假設(shè)未檢測出目的蛋白，分析可能的原因有目的基因在受體細(xì)胞中沒有表達(dá)．（寫出一種即可）

Answer 1

分析 1．基因工程的工具酶是限制酶和DNA連接酶，一種限制酶只能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成粘性末端或平末端；
2．DNA連接酶只能連接相同的粘性末端，若用同種限制酶切割，則容易形成質(zhì)粒或目的基因自身環(huán)化的結(jié)構(gòu)；
3．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，必須包含目的基因、標(biāo)記基因、啟動子、終止子及復(fù)制原點(diǎn)等結(jié)構(gòu)．

解答 解：（1）根據(jù)題意：在pBV220載體（圖A）多克隆位點(diǎn)的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間插入目的基因IL1-His，構(gòu)建表達(dá)載體pBV-IL1-His（圖B），故為了防止目的基因和pBV220載體在酶切后的末端發(fā)生任意連接，導(dǎo)致自身環(huán)化，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ；根據(jù)圖示，為插入前的載體為3666bp，但插入目的基因之后的長度為4153bp，故目的基因的長度為4153-3666=487bp；構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，必須包含目的基因、標(biāo)記基因（氨芐青霉素抗性基因）、啟動子、終止子等結(jié)構(gòu)．
（2）將目的基因?qū)�入�?xì)菌等微生物的方法是感受態(tài)細(xì)胞法，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌時(shí)需要用Ca²⁺處理細(xì)胞；利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA時(shí)，不需要加入解旋酶，原理是DNA的熱變性，將雙鏈DNA加熱到90℃以上，目的是使雙鏈DNA變性，解聚為單鏈．
（3）基因工程的最后一步是目的基因的檢測與鑒定，檢測目的基因是否表達(dá)成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，方法是抗原-抗體雜交技術(shù)；假設(shè)未檢測出目的蛋白則目的基因表達(dá)不成功，原因可能是目的基因在受體細(xì)胞中沒有表達(dá)．
故答案為：
（1）EcoRⅠ和BamHⅠ487      啟動子、終止子
（2）Ca²⁺使雙鏈DNA變性，解聚為單鏈
（3）抗原-抗體雜交     目的基因在受體細(xì)胞中沒有表達(dá)

點(diǎn)評 本題重點(diǎn)考查基因工程的有關(guān)知識，要求掌握基因工程的操作步驟及在生產(chǎn)實(shí)踐中的運(yùn)用；能夠?qū)�基因工程中DNA片段的長短進(jìn)行簡單的計(jì)算，難度適中．