Question

4．科研人員通過(guò)基因工程實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶基因在豬腸道野生酵母菌中的表達(dá)，使原來(lái)不能被豬利用的粗纖維在豬腸道內(nèi)被分解成可直接吸收的單糖．如圖為構(gòu)建工程菌的部分過(guò)程，其中介導(dǎo)序列能引導(dǎo)載體整合到酵母菌的染色體DNA上．請(qǐng)回答：

限制酶	識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
EcoRⅠ	↓ GAATTC
BamHⅠ	↓ GGATCC
BglⅡ	↓ AGATCT
SalⅠ	↓ GTCGAC

（1）①過(guò)程中需要的工具酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，②③過(guò)程中需要的工具酶是（限制酶和）DNA連接酶．
（2）同尾酶是指切割DNA分子后能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶，圖中4種限制酶中屬于同尾酶的是BamHⅠ和BglⅡ．
（3）重組表達(dá)載體中的介導(dǎo)序列引導(dǎo)目的基因整合到酵母菌的染色體DNA上，其意義在于使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達(dá)．
（4）①過(guò)程從野生酵母菌染色體DNA中PCR擴(kuò)增介導(dǎo)序列時(shí)，科研人員設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物：和 ，其中下劃線部分序列的設(shè)計(jì)依據(jù)是介導(dǎo)序列兩端的部分DNA序列，方框部分序列的設(shè)計(jì)目的是使擴(kuò)增出的介導(dǎo)序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列．
（5）對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)．若使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，得到3種DNA片斷．若使用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，得到2種DNA片斷．

Answer 1

分析 分析題圖：圖示為構(gòu)建工程菌的部分過(guò)程，其中①表示采用PCR技術(shù)擴(kuò)增介導(dǎo)序列的過(guò)程；②是用DNA連接酶將質(zhì)粒載體與介導(dǎo)序列連接形成重組質(zhì)粒的過(guò)程；③表示用DNA連接酶將質(zhì)粒載體、介導(dǎo)序列質(zhì)粒載體和克隆載體重新組成形成重組表達(dá)載體．

解答 解：（1）圖中①表示采用PCR技術(shù)擴(kuò)增介導(dǎo)序列的過(guò)程，該過(guò)程在高溫條件下進(jìn)行，需要熱穩(wěn)定性DNA聚合酶；②③表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，除了圖中的限制酶外，該過(guò)程中還需要DNA連接酶．
（2）表中限制酶BamHⅠ和BglⅡ的識(shí)別序列不同，但兩者切割產(chǎn)生的黏性末端相同，屬于同尾酶．
（3）轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵．重組表達(dá)載體中的介導(dǎo)序列引導(dǎo)目的基因整合到酵母菌的染色體DNA上，這可使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達(dá)．
（4）①過(guò)程從野生酵母菌染色體DNA中PCR擴(kuò)增介導(dǎo)序列時(shí)，科研人員設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物：GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG和TTGCATTGACTTACACCTAGG，引物是根據(jù)已知核苷酸序列設(shè)計(jì)的，因此其中下劃線部分序列的設(shè)計(jì)依據(jù)是介導(dǎo)序列兩端的部分DNA序列；GAATTC是限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列，而CCTAGG是限制酶BamHⅠ的識(shí)別序列，因此方框部分序列的設(shè)計(jì)目的是使擴(kuò)增出的介導(dǎo)序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列．
（5）由圖可知，重組的基因表達(dá)載體含有2個(gè)EcoRⅠ酶割位點(diǎn)，含有1個(gè)SalⅠ酶切位點(diǎn)，因此使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切重組質(zhì)�？梢缘玫�3種DNA片斷．重組的基因表達(dá)載體含有2個(gè)EcoRⅠ酶割位點(diǎn)，但不再含有BamHⅠ酶割位點(diǎn)，因此用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重組質(zhì)�？梢缘玫�2種DNA片斷．
故答案為：
（1）熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶或耐高溫的DNA聚合酶）  （限制酶和）DNA連接酶
（2）BamHⅠ和BglⅡ
（3）使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達(dá)
（4）介導(dǎo)序列兩端的部分DNA序列    使擴(kuò)增出的介導(dǎo)序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列
（5）3    2

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合構(gòu)建工程菌的部分過(guò)程圖解，考查基因工程的技術(shù)和原理，要求考生識(shí)記基因工程的工具和操作步驟，能根據(jù)圖中和表中信息答題．需要注意的是第（5）題，考生可以將重組表達(dá)載體上的酶切位點(diǎn)標(biāo)出，明確BamHⅠ和BglⅡ切割后的黏性末端能在DNA連接酶的作用下連接起來(lái)，但重組序列不能被BamHⅠ或BglⅡ酶割．