Question

20．?dāng)U增多個目的基因用PCK技術(shù)．如圖1為某種常用質(zhì)粒的序列圖，Lac Z基因編碼的酶能使無色的X-gal變?yōu)樗{(lán)色，Amp^r為氨芐青霉素抗性基因．圖2為目的基因的序列及其相關(guān)限制酶的識別序列．請回答下列問題：

（1）若要篩選成功導(dǎo)入目的基因的重組質(zhì)粒，培養(yǎng)基中應(yīng)加入的物質(zhì)有X-gal、氨芐青霉素．
（2）用圖中的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，不能（填“能”或“不能”）實現(xiàn)目的基因與質(zhì)粒的定向連接？原因是BamHI和BgⅡ兩種限制酶切得黏性末端相同．
（3）將若干個質(zhì)粒和目的基因用BamHI和BgⅡ兩種限制酶切割后，用DNA連接酶相連，然后再用BamH I和EcoR I切割成功連接后的產(chǎn)物，獲得了長度為0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四種長度的DNA片段，則目的基因的長度為1.8kb（已知目的基因的長度大于1kb，lkb=1000個堿基對）．
（4）PCK技術(shù)中所用的引物是根據(jù)目的基因 的一段核苷酸序列合成的．如表是用于擴增A、B、C三種基因的引物：

A基因	引物1	5′GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3′
	引物2	5′GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3′
B基因	引物1	5′TGAATCCTGTTGCCGGTCTT3′
	引物2	5′AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC3′
C基因	引物1	5′CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3′
	引物2	5′GCGTCATGATCGGCTCGATG3′

據(jù)表分析，引物特異性主要表現(xiàn)在核苷酸的數(shù)目不同、序列不同；每個基因?qū)��?yīng)的引物1和引物2之間不能互補配對．
（5）PCR過程中溫度從90℃降到55-60℃的目的是使引物與模板鏈相應(yīng)序列互補結(jié)合．

Answer 1

分析 1、根據(jù)題意和圖示1、2分析可知：質(zhì)粒中，氨芐青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都屬于標(biāo)記基因，目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ兩種酶的酶切位點，質(zhì)粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ兩種酶的酶切位點．一般為了防止目的基因和質(zhì)粒反向連接，用兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒．
2、PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)．
（1）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物．
（2）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）．
（3）過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈．

解答 解：（1）由于Lac Z基因編碼的酶能使無色的X-gal變?yōu)樗{(lán)色，Amp為氨芐青霉素抗性基因，所以若要篩選成功導(dǎo)入目的基因的重組質(zhì)粒，培養(yǎng)基中應(yīng)加入的物質(zhì)有X-gal和氨芐青霉素．
（2）由于BamHI和BgⅡ兩種限制酶切得黏性末端相同，不能實現(xiàn)目的基因與質(zhì)粒的定向連接．
（3）根據(jù)BamHⅠ和BlgⅡ兩種酶識別的序列為G↓GATCC、A↓GATCT．質(zhì)粒上存在BamHI的切割位點，假設(shè)用a和b表示．目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ兩種酶的酶切位點，假設(shè)分別用c和d表示．那么目的基因與質(zhì)粒鏈接的方式可能有兩種，如圖所示：

用BamHⅠ切割和EcoRⅠ切割成功連接后的產(chǎn)物，獲得了長度為0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四種長度的DNA片段．
①如果BamHⅠ切割ac處，可能的情況如圖：

②如果BamHⅠ切割ac處，可能的情況如圖，

據(jù)圖比較可推斷出目的基因的長度為1.8Kb．
（4）PCR擴增技術(shù)的前提是要用一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一段序列合成引物．據(jù)表中A、B、C三種基因的引物核苷酸序列分析，引物特異性是引物中特定的堿基序列和核苷酸的數(shù)目不同．每種基因擴增需要一對特異性的引物，要求一對引物的序列是不互補的，否則會形成引物二聚體，進(jìn)而影響目的基因的擴增．
（5）PCR過程中溫度從90℃降到55-60℃的目的是使引物與模板鏈相應(yīng)序列互補結(jié)合．
故答案為：
（1）X-gal     氨芐青霉素
（2）不能     BamHI和BgⅡ兩種限制酶切得黏性末端相同
（3）1.8
（4）目的基因     核苷酸的數(shù)目不同、序列不同      互補配對
（5）使引物與模板鏈相應(yīng)序列互補結(jié)合

點評 本題結(jié)合重組質(zhì)粒形成示意圖和各種引物的核苷酸序列，綜合考查了考查基因工程和PCR技術(shù)的相關(guān)知識，重點考查基因工程的步驟，要求考生識記基因工程的步驟，掌握重組質(zhì)粒的篩選方法，能運用所學(xué)的知識，結(jié)合題圖，判斷導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能否在相應(yīng)的培養(yǎng)基中生存．