Question

【題目】回答有關(guān)乳腺生物反應(yīng)器問題。

Ⅰ．人組織纖溶酶原激活物（htPA）是一種重要的藥用蛋白，可在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中獲得。流程如下：

（1）htPA基因與載體用同種__________切割后，通過DNA連接酶連接，以構(gòu)建重組表達載體。檢測目的基因是否已插入受體細胞DNA，可采用_______________________技術(shù)。

（2）為獲取更多的卵（母）細胞，要對供體母羊注射促性腺激素，使其__________。采集的精子需要經(jīng)過__________，才具備受精能力。

（3）將重組表達載體導(dǎo)入受精卵常用的方法是__________。為了獲得母羊，移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行____________。移植后對受體母羊還需進行____________的檢查。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體，這體現(xiàn)了早期胚胎細胞的____________。

（4）若在轉(zhuǎn)ht-PA基因母羊的羊乳中檢測到____________，說明目的基因成功表達。

Ⅱ．科研人員采用轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因綿羊，以便通過乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人凝血因子IX醫(yī)用蛋白，其技術(shù)路線如圖。

（1）由過程①獲得的A為________________________。

（2）在核移植之前，必須先去掉受體卵母細胞的核，目的是___________________。受體應(yīng)選用____________期卵母細胞。

（3）進行胚胎移植時，代孕母羊?qū)σ迫胱訉m的重組胚胎基本上不發(fā)生____________，這為重組胚胎在代孕母羊體內(nèi)的存活提供了可能。

（4）采用胎兒成纖維細胞進行轉(zhuǎn)基因體細胞克隆，理論上可獲得無限個轉(zhuǎn)基因綿羊，這是因為______________________________。

Answer 1

【答案】限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶） DNA分子雜交技術(shù) 超數(shù)排卵 或能處理 顯微注射法性 性別鑒定 是否妊娠 全能性 人組織纖溶酶原激活物（htPA） 含目的基因的表達載體 保證核遺傳物質(zhì)來自含目的基因的成纖維細胞 MⅡ 免疫排斥反應(yīng) 整合有目的基因的成纖維細胞可進行傳代培養(yǎng)

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
胚胎移植的生理基礎(chǔ)
（1）供體與受體相同的生理變化，為供體的胚胎植入受體提供了相同的生理環(huán)境；
（2）胚胎在早期母體中處于游離狀態(tài)，這就為胚胎的收集提供了可能；
（3）子宮不對外來胚胎發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)的存活提供了可能；
（4）胚胎遺傳性狀不受受體任何影響。

Ⅰ．（1）htPA基因可以直接從人體細胞中獲取，并通過技術(shù)PCR大量擴增。htPA基因與載體用限制酶切割后，再通過DNA連接酶連接，以構(gòu)建重組表達載體。檢測目的基因是否已插入受體細胞DNA，可采用DNA分子雜交（或核酸探針）技術(shù)。
（2）為獲取更多的卵（母）細胞，要對供體母羊注射促性腺激素，使其超數(shù)排卵。采集的精子需要經(jīng)過獲能處理，才具備受精能力。通常采用的體外獲能方法有培養(yǎng)法和化學(xué)誘導(dǎo)法。
（3）將重組表達載體導(dǎo)入羊受精卵常用的方法是顯微注射法。為了獲得轉(zhuǎn)基因母羊，移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行性別鑒定。移植后還要對受體母羊進行是否妊娠的檢查。還可對所獲得的胚胎進行胚胎分割可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體，這說明早期胚胎細胞具有全能性。（4）若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測到htPA（或人組織纖溶酶原激活物），說明目的基因成功表達。顯示達到了我們預(yù)期的目的。
Ⅱ．（1）要想目的基因只在乳腺組織中表達，在構(gòu)建基因表達載體時，需要將人的血清白蛋白基因和乳腺組織特異性表達的啟動子等調(diào)控組建重組在一起，過程①獲得的A為含目的基因的表達載體。
（2）在核移植之前，必須先去掉受體卵細胞的核，目的是保證核遺傳物質(zhì)來自含目的基因的成纖維細胞，核移植的受體應(yīng)選用處于MⅡ中期的卵母細胞，以便重組細胞全能性的發(fā)揮。
（3）進行胚胎移植時，代孕母羊?qū)σ迫胱訉m的重組胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，這為重組胚胎在代孕母羊體內(nèi)的存活提供了可能。胚胎移植時，一般選擇發(fā)育良好的桑椹胚或囊胚。
（3）因為整合有目的基因的成纖維細胞可進行傳代培養(yǎng)，因此采用胎兒成纖維進行轉(zhuǎn)基因體細胞克隆，理論上可獲得無限個轉(zhuǎn)基因綿羊。