Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

乳糖酶催化乳糖水解，能用于治療人類的乳糖不耐癥，乳糖酶可來自多種酵母菌菌株，現(xiàn)要開展高產(chǎn)乳糖酶酵母菌的篩選、酶的固定化及其特性的研究。請(qǐng)回答：

（1）目標(biāo)菌株的篩選。已知X-gal在乳糖酶的催化下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，將初步篩選得到的菌株在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行______________________，稀釋后涂布接種到以______________________為唯一碳源、表面均勻涂有X-gal的固體培養(yǎng)基上，最后應(yīng)挑選______________________較大的單菌落作為目標(biāo)菌株。

（2）酶的分離純化。若某高產(chǎn)菌株合成的乳糖酶大部分分泌到菌體外，則可取適宜培養(yǎng)菌液經(jīng)離心處理，取______________________進(jìn)行酶的分離純化；若高產(chǎn)菌株合成的乳糖酶不分泌到菌體外，需先經(jīng)過______________________處理后，再進(jìn)行上述處理。

（3）酶的固定化。磁性殼聚糖微球是一種新型高分子材料，它表面的氨基可以與蛋白質(zhì)分子的羧基反應(yīng)生成肽鍵，固定后的酶并未形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這一固定方法為______________________法；與教材中α-淀粉酶的固定方法相比，用此法固定的主要優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)分別是______________________、___________________。

（二）研制針對(duì)新冠病毒的單克隆抗體為抗擊新冠肺炎疫情的重要途徑。N蛋白是新冠病毒的核心蛋白之一，下圖表示研制針對(duì)N蛋白的單克隆抗體的基本過程，①-⑦表示相關(guān)過程。請(qǐng)回答：

（1）N蛋白基因是利用______________法得到的，利用基因工程生產(chǎn)N蛋白的核心步驟是圖中的過程______________（用數(shù)字序號(hào)回答）；過程③常用CaCl2溶液處理的目的是增大大腸桿菌______________的通透性，上述制備過程要選用大腸桿菌作為受體細(xì)胞而不用酵母菌的主要原因是因?yàn)榻湍妇?/span>____________________________。

（2）過程⑤的目的是刺激小鼠并在體內(nèi)產(chǎn)生更多的______________細(xì)胞，過程⑥需要經(jīng)過誘導(dǎo)融合、多次篩選，以及______________，產(chǎn)生符合要求的雜交瘤細(xì)胞株。

（3）在抗疫初期，新聞里看到很多康復(fù)者在捐獻(xiàn)血漿，用于治療其他病人，但這種血漿療法不適宜推廣應(yīng)用，其原因除了捐獻(xiàn)者的人數(shù)和血漿數(shù)量有限外，結(jié)合單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)，還有______________、______________（至少寫兩個(gè)方面）。

Answer 1

【答案】擴(kuò)大培養(yǎng) 乳糖 藍(lán)色透明圈（或藍(lán)色透明圈直徑與菌落直徑比值） 上清液 細(xì)胞破碎 共價(jià)偶聯(lián) 與酶的結(jié)合較牢固，不易分離 容易導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致酶活性的下降 化學(xué)合成 ② 細(xì)胞壁 為真核生物，要對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA作進(jìn)一步加工后再翻譯（或“合成的蛋白質(zhì)有的還要經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工，影響N蛋白的生產(chǎn)”） 效應(yīng)B淋巴（漿） 克隆培養(yǎng) 康復(fù)者的血漿中含有多種抗體，缺乏特異性 不能直接進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)

【解析】

1．基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

2.單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原的抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的效應(yīng)B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖。用具備這種特性的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對(duì)一種抗原的特異性抗體即單克隆抗體。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

（一）（1）待選菌株初選得到后，先經(jīng)過在液體培養(yǎng)基中的擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)稀釋涂布到以乳糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)得到許多的單菌落，根據(jù)得到的藍(lán)色透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落作為目標(biāo)菌株。

（2）若乳糖酶為分泌酶，可直接離心取上清液進(jìn)行酶的分離純化；若乳糖酶為胞內(nèi)酶，需先經(jīng)過細(xì)胞破碎處理后，再離心取上清液進(jìn)行酶的分離純化。

（3）磁性殼聚糖微球作為載體是與被固定的酶分子形成共價(jià)鍵，說明是化學(xué)固定法，由于未形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故為共價(jià)偶聯(lián)法。教材中α-淀粉酶的固定方法為吸附法，與吸附法相比較，共價(jià)偶聯(lián)法的主要優(yōu)點(diǎn)是與酶的結(jié)合力大，不易分離，固定效果好，主要缺點(diǎn)是化學(xué)結(jié)合時(shí)容易導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響酶的活性。

（二）（1）本例以新冠病毒的N蛋白作為抗原，通過雜交瘤技術(shù)制備特異性強(qiáng)的單克隆抗體。N蛋白基因是以其氨基酸序列推算出來的然后用人工方法合成的，這里合成基因的方法應(yīng)是化學(xué)合成法；再利用基因工程技術(shù)獲得大量的N蛋白，基因工程的核心步驟應(yīng)是重組DNA的過程即圖中的②；將重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，通常利用氯化鈣進(jìn)行處理，處理的目的是增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，從而提高轉(zhuǎn)化的成功率；在這里不用酵母菌作為受體細(xì)胞的主要原因是酵母菌為真核生物，目的基因轉(zhuǎn)錄后要加工，并且合成多肽鏈后還需經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工，會(huì)影響N蛋白的產(chǎn)生。

（2）過程⑤是利用抗原刺激小鼠，使其體內(nèi)產(chǎn)生更多的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，過程⑥是雜交瘤細(xì)胞的制備過程，經(jīng)融合、篩選，最后經(jīng)克隆培養(yǎng)得到相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。

（3）單克隆抗體具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高，可大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，而異體血漿存在供應(yīng)不足，而且血漿中含有多種抗體，缺乏特異性，同時(shí)也易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)等，因此與單克隆抗體相比，除了純度低導(dǎo)致的特異性差，靈敏度低的缺點(diǎn)外，更重要的是不能直接進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。