Question

【題目】基因檢測(cè)是指通過(guò)檢測(cè)生物體中的DNA序列，以了解生物體基因狀況的技術(shù)手段。Sanger雙脫氧鏈終止法是DNA測(cè)序的基本方法，其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、帶有3′-OH末端的單鏈核苷酸引物、四種dNTP存在的條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在反應(yīng)系統(tǒng)中分別引人單一種類(lèi)的ddNTP（即2、3雙脫氧核苷三磷酸，在脫氧核糖的3′位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵），只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入dNTP的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。通過(guò)電泳將不同長(zhǎng)度的片段分開(kāi)，DNA片段越小，距離起點(diǎn)越遠(yuǎn)，根據(jù)末端核苷酸可得到原始序列信息。具體流程圖如下。

（1）若待測(cè)核酸模板為雙鏈DNA，首先要作____________處理，與引物結(jié)合后，在DNA聚合酶作用下子鏈沿____________方向（填“5′端向3′端”或“3′端向5′端”）進(jìn)行延伸反應(yīng)。若待測(cè)核酸模板為RNA，則需要在____________酶的幫助下合成DNA單鏈片段。

（2）ddNTP為2，3-雙脫氧核苷三磷酸，只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)的原因是____________。

（3）假設(shè)某反應(yīng)體系中，待測(cè)DNA單鏈序列3′GTACCGTA5′，加入4種dNTP和ddATP，經(jīng)過(guò)雙脫氧鏈終止法處理，會(huì)得到____________種片段，其中最短的片段序列是____________。

（4）假設(shè)某次Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序得到的電泳圖如上圖所示，則待測(cè)DNA序列從5′端到3′端為____________。

Answer 1

【答案】變性 從5′端向3′端 逆轉(zhuǎn)錄酶 3號(hào)碳上不是羥基，不能與下一個(gè)脫氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯鍵 3 CddA ATGGTCATCA

【解析】

讀取信息“在反應(yīng)系統(tǒng)中分別引人單一種類(lèi)的ddNTP（即2、3雙脫氧核苷三磷酸，在脫氧核糖的3′位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵），只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入dNTP的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)”“DNA片段越小，距離起點(diǎn)越遠(yuǎn)，根據(jù)末端核苷酸可得到原始序列信息”進(jìn)行解答。

（1）測(cè)定雙鏈DNA的序列需要將DNA進(jìn)行變性處理，獲得單鏈DNA分子；由于引物是3′-OH末端的單鏈核苷酸，所以子鏈沿著5′端向3′端進(jìn)行延伸反應(yīng)；利用RNA獲得DNA單鏈的過(guò)程是逆轉(zhuǎn)錄，所以需要逆轉(zhuǎn)錄酶。

（2）根據(jù)題干信息，ddNTP為2，3-雙脫氧核苷三磷酸其3號(hào)碳上不是羥基，不能與下一個(gè)脫氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯鍵，所以只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)。

（3）ddATP帶有堿基腺嘌呤，和胸腺嘧啶配對(duì)，從5′端向3′端延伸，由于待測(cè)序列含有2個(gè)胸腺嘧啶，所以可以獲得5′CddA3′，5′CATGGCddA3′，5′CATGGCAT3′共3種片段，最短的序列是CddA。

（4）根據(jù)題干信息“DNA片段越小，距離起點(diǎn)越遠(yuǎn)，根據(jù)末端核苷酸可得到原始序列信息”根據(jù)電泳序列，使用ddT獲得了3個(gè)片段，其中有最小的和最大片段，因此該DNA序列的第一個(gè)和最后一個(gè)堿基都是A；按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，獲得序列ATGGTCATCA。