Question

6．Vash2基因在肝癌、卵巢癌、乳腺癌等組織中表達程度較高，有促進腫瘤血管生成的作用．為研究其具體作用機制，研究者應用Cas9/sgRNA系統(tǒng)構建了Vash2基因敲除的小鼠模型，該系統(tǒng)作用機理如圖1所示．

（1）Cas9系統(tǒng)最早在細菌體內發(fā)現(xiàn)，是細菌用來抵御噬菌體DNA等外源DNA片段入侵而建立的機制，相當于人類的免疫系統(tǒng)．
（2）為敲除Vash2基因，需要設計sgRNA（單鏈向導RNA），由圖可知，sgRNA的一段序列能與Vash2基因進行堿基互補配對．研究者通過顯微注射技術將sgRNA和Cas9mRNA導入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引導由Cas9mRNA通過翻譯過程產生的Cas9酶在配對區(qū)域定點剪切，使Vash2基因片段Ⅱ（填圖中羅馬數(shù)字）發(fā)生缺失從而導致基因突變．
（3）被敲除基因的鼠經胚胎移植，最后獲得44只F₀代小鼠，經PCR檢測和基因測序，從中選出1號、3號、5號、39號為陽性高效敲除小鼠．由于是隨機敲除，導致不同個體丟失的基因片段大小不同，具體情況見表

編號	敲除的總片段長度（bp）	敲除的有效片段長度（bp）
1（♂）	169	169
3（♂）	196	196
5（♀）	429	268
39（♀）	483	200

盡管得到的四只小鼠都是純合子，但由于丟失片段不同，通常F₀代小鼠之間不能相互交配．為了得到能穩(wěn)定傳代的Vash2基因敲除純合子，研究者從上表中選擇5號小鼠和野生雄性鼠交配，得到F₁代Vash2雜合子．選擇5號小鼠的原因是：5號小鼠敲除的有效片段長度較大．
（4）F₁代小鼠相互交配得到F₂代，將F₂代小鼠進行Vash2基因PCR電泳檢測，結果如圖2所示．A、B、C三種小鼠中代表Vash2基因敲除純合子的是A，這種類型的小鼠在F₂代中的比例理論上為25%．

Answer 1

分析 根據題意和圖示分析可知：敲除基因時，sgRNA與Vash2基因的部分序列互補配對，細胞內的Cas9酶在配對區(qū)域定點剪切，引起Vash2基因發(fā)生堿基對缺失，導致基因突變．該過程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用類似于限制酶的作用，敲除后需要DNA連接酶對DNA上的切口進行修復．

解答 解：（1）細菌內的Cas9系統(tǒng)可抵御噬菌體DNA等外源DNA片段入侵，相當于人類的免疫系統(tǒng)，對自身起保護作用．
（2）據圖可知，sgRNA的一段序列能與Vash2基因進行雜合，說明兩者之間進行堿基互補配對．小鼠屬于動物，所以研究者可通過顯微注射技術將sgRNA和Cas9mRNA導入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引導由Cas9mRNA通過翻譯過程產生的Cas9酶在配對區(qū)域定點剪切，使Vash2基因片段Ⅱ發(fā)生缺失，堿基對減少，從而導致基因突變．
（3）根據題意和圖表分析可知：在1號、3號、5號、39號中，5號小鼠（♀）敲除的有效片段長度較大，為268bp，所以可選擇5號小鼠和野生雄性鼠交配，得到F₁代Vash2雜合子．
（4）將F₂代小鼠進行Vash2基因PCR電泳檢測，A中沒有Vash2標識序列，說明其代表Vash2基因敲除純合子．由于F₁代小鼠相當于雜合子，所以這種類型的小鼠在F₂代中的比例理論上為25%．
故答案為：
（1）免疫
（2）進行堿基互補配對        顯微注射     翻譯Ⅱ
（3）野生雄性      5號小鼠敲除的有效片段長度較大
（4）A      25%

點評 本題以“基因敲除”為題材，考查了基因工程以及基因分離定律的有關知識，要求考生能夠根據實驗表格數(shù)據得出相應的實驗結論，能夠根據敲除過程圖解明確敲除的本質，并能夠利用測交實驗對敲除實驗結果進行驗證，具有一定的難度．