Question

【題目】圖甲為構建重組質(zhì)粒過程中的三種備選質(zhì)粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉(zhuǎn)AFPs基因（抗凍基因）番茄的示意圖，外源DNA和質(zhì)粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因，請回答下列問題。

（1）圖甲中通常選用質(zhì)粒C構建重組質(zhì)粒，而不選用質(zhì)粒A或質(zhì)粒B的原因分別是____。

（2）據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應優(yōu)先選用限制酶______________切割目的基因和質(zhì)粒。

（3）在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是___________________________________。

（4）圖乙農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒應含有T-DNA，其作用是___________。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質(zhì)，該過程需用到________工程。

（5）為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設計質(zhì)粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為______。

Answer 1

【答案】質(zhì)粒A中沒有標記基因，質(zhì)粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（高效表達） 攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA 蛋白質(zhì) 750bp

【解析】

1.基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運載體：常用的運載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

2.基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

3.蛋白質(zhì)過程的基本途徑是：從預期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設計預期的蛋白質(zhì)結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）。

(1)質(zhì)粒A缺乏標記基因，質(zhì)粒B的復制原點中含有限制酶切割位點，可能會破壞復制原點，質(zhì)粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質(zhì)粒C作為基因工程的載體，結合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamH'和Hind 1同時切割，或者EcoR'和Hindll同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應優(yōu)先選用限制酶BamHI (會破壞Tc) 和HindIl切割，可以根據(jù)是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）啟動子是RNA聚合酶結合的位點，是起始轉(zhuǎn)錄的位點，雙啟動子可能是保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（高效表達）。

（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的Ti質(zhì)粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA中。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質(zhì)，該過程是通過設計蛋白質(zhì)序列推測相關的基因序列，進而對AFPs基因進行改造，然后用改造后的基因指導更強抗凍蛋白的合成來完成的，該過程屬于蛋白質(zhì)工程范疇。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。說明EcoRI酶有2個酶切位點，且兩.個位點之間的最短距離是500bp，而KpnI酶的切點在2個EcoRI酶切點之間，且距離每個EcoRI酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRI酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRI酶切點的距離是500+500=1000bp。故KpnI酶切割位點與HindIII酶切割位點最短長度250+500=750 bp。