Question

6．請回答基因工程方面的有關(guān)問題：
（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如圖所示）．圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)．

①理論上推測，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為$\frac{15}{16}$．
②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段．
（2）設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一．某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（如圖），請分別說明理由．
①第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效；
②第2組：引物Ⅰ'自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效．
（3）PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上．

（4）用限制酶EcoRV、MboⅠ單獨或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段長度如下圖（1kb即1000個堿基對），請畫出質(zhì)粒上EcoRV、MboⅠ的切割位點．

Answer 1

分析 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程為：變性、退火、延伸．根據(jù)PCR過程的特點繪制PCR過程示意圖如圖所示：

據(jù)圖答題．

解答 解：（1）①由圖可知，由原來的每條母鏈為模板合成的兩個新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時，兩種引物都含有，故第四輪循環(huán)共產(chǎn)生16個DNA分子，其中含有引物A的分子是15個，占$\frac{15}{16}$．
②由圖示可知，第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，如上圖．
（2）在第1組引物中，引物Ⅰ的部分堿基序列是CAGGCT，引物Ⅱ的部分堿基序列是AGCCTG，若利用這兩個引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增，會因其中的部分堿基發(fā)生堿基互補配對而使引物失效．在第2組引物中，引物Ⅰ′的部分堿基序列是AACTG和CAGTT，該引物一旦發(fā)生自身折疊，也將會出現(xiàn)部分堿基發(fā)生堿基互補配對而使引物失效．
（3）圖中直接將兩個脫氧核苷酸合成DNA單鏈，這不能反映DNA聚合酶的功能，因為DNA聚合酶只能在DNA模板存在的條件下，將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上．
（4）根據(jù)圖示，該質(zhì)粒為環(huán)形質(zhì)粒．用限制酶EcoRⅤ單獨切割該質(zhì)粒時，只形成一個片段，說明該質(zhì)粒上只有1個限制酶EcoRⅤ的識別位點．用限制酶MboⅠ單獨切割該質(zhì)粒時，形成兩個片段，說明該質(zhì)粒上有兩個限制酶MboⅠ的識別位點．用限制酶EcoRⅤ和MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒時，形成三個片段，其中有一個片段的長度與用MboⅠ單獨切割該質(zhì)粒時產(chǎn)生的片段長度相同（2.5kb），另外的兩個片段是5.5kb和6kb，這說明限制酶EcoRⅤ的切割位點存在于用MboⅠ單獨切割該質(zhì)粒時產(chǎn)生的另一片段（11.5kb）上．質(zhì)粒上EcoRV、MboI的切割位點如圖所示．
故答案為：
（1）①$\frac{15}{16}$     ②三
（2）①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效
②引物Ⅰ'自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效
（3）DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上
（4）見圖

點評 本題結(jié)合PCR過程示意圖，考查PCR技術(shù)、DNA分子復(fù)制、基因工程等知識，要求考生識記PCR技術(shù)的過程及原理，能分析題圖提取有效信息答題；掌握DNA分子半保留復(fù)制特點，能進(jìn)行簡單的計算；能根據(jù)題干信息判斷限制酶在質(zhì)粒上的位置．