Question

【題目】圖甲表示含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度（bp即堿基對(duì)）和部分堿基序列，圖乙表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列。現(xiàn)有Msp Ⅰ、 BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

【1】用圖甲中的外源DNA（含有目的基因D）和圖乙中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和______________________________。前者（酶）的專一性很強(qiáng)，其作用特點(diǎn)是________________________________________。

【2】應(yīng)該使用限制酶BamH Ⅰ同時(shí)處理質(zhì)粒外源DNA，而不選擇其他3種，原因在于（ ）

A.若使用Sma Ⅰ或者Msp I會(huì)破壞目的基因。

B.若使用Sma Ⅰ切割質(zhì)粒，能成功切開(kāi)質(zhì)粒得到粘性末端的可能很低。

C.若使用Mbo Ⅰ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會(huì)有2處被切開(kāi)，會(huì)將質(zhì)粒切成兩段不利于篩選。

D.使用限制酶BamH Ⅰ能保證目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，以便目的基因和運(yùn)載體定向連接，不至于反向連接。

E.使用BamH Ⅰ切割質(zhì)粒質(zhì)粒上會(huì)有1處被切開(kāi)，破壞抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于將來(lái)篩選含目的基因的受體細(xì)胞。

F.只有使用BamH Ⅰ切割，才能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端。

【3】若圖甲中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T-A堿基對(duì)替換，那么基因D就突變?yōu)榛��?/span>d。從雜合子分離出圖甲及其對(duì)應(yīng)的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，產(chǎn)物中共有_________種不同DNA片段。若同時(shí)用限制酶Msp Ⅰ、Mbo Ⅰ切割圖乙中的質(zhì)粒，則可得到__________個(gè)DNA片段。

【4】為了篩選出成功導(dǎo)入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般可進(jìn)行如下步驟篩選：

第一步：將大腸桿菌在含__________的培養(yǎng)基上，得到如下左圖的菌落。

第二步：再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含__________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如下右圖的結(jié)果（空圈表示與左圖對(duì)照無(wú)菌落的位置）。

第三步：選出左圖培養(yǎng)皿中的某些菌落進(jìn)行培養(yǎng)，即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。請(qǐng)?jiān)谙路阶髨D中圈出含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落__________。

【5】以上篩選方式至少需要兩步，其實(shí)還有其他更簡(jiǎn)單的操作方法。請(qǐng)閱讀下列材料，回答問(wèn)題：

大腸桿菌pUC118質(zhì)粒的某限制酶唯酶切序列，位于該質(zhì)粒的lacZ基因中。lacZ基中如果沒(méi)有插入外源基因，便可表達(dá)出β一半乳糖苷酶。當(dāng)培養(yǎng)基中含有A物質(zhì)時(shí)，A物質(zhì)便會(huì)被β一半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達(dá)β一半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會(huì)被水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成白色菌落。pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因。下圖是利用a基因篩選重組質(zhì)粒示意圖。

用下圖中的培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的受體大腸桿菌，制備時(shí)除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還應(yīng)加入物質(zhì)應(yīng)包括（ ）

A.伊紅美藍(lán)試劑B.瓊脂C.A物質(zhì)D.氨芐青霉素

【6】將上述處理后的大腸桿菌置于圖中培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以檢測(cè)受體大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒，結(jié)果可能出現(xiàn)藍(lán)色或者白色菌落，其中__________色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌。

Answer 1

【答案】

【1】 DNA連接酶 能夠識(shí)別特定的堿基序列并加以切割

【2】ACE

【3】 4 3

【4】 抗生素B 抗生素A

【5】BCD

【6】白

【解析】

基因工程中需要使用的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和運(yùn)載體，其中限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)是能夠識(shí)別特定的堿基序列并加以切割。對(duì)目的基因和運(yùn)載體進(jìn)行處理時(shí)需要選擇可以產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶，同時(shí)要保證運(yùn)載體上標(biāo)記基因的完整，以便后續(xù)進(jìn)行檢測(cè)。

【1】用圖甲中的外源DNA（含有目的基因D）和圖2中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和DNA連接酶；限制酶的專一性很強(qiáng)，其作用特點(diǎn)是能夠識(shí)別特定的堿基序列并加以切割；

【2】A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ會(huì)從目的基因的內(nèi)部切割，會(huì)破壞目的基因，A正確；

B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是這種酶切割目的基因會(huì)破壞目的基因，同時(shí)利用這種酶切割質(zhì)粒，不可能得到粘性末端，B錯(cuò)誤；

C、若使用MboⅠ切割質(zhì)粒，由于其識(shí)別的序列為GATC，質(zhì)粒上會(huì)有2處被切開(kāi)，并且導(dǎo)致兩個(gè)抗性基因均會(huì)被破壞，這將不利于篩選，C正確；

D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，使目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，但這會(huì)導(dǎo)致目的基因和運(yùn)載體反向連接，D錯(cuò)誤；

E、使用BamHⅠ切割質(zhì)粒，觀察質(zhì)粒上的識(shí)別序列可以發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒上會(huì)有1處被切開(kāi)，導(dǎo)致抗生素A抗性基因被破壞，保留抗生素B抗性基因，這樣便于將來(lái)篩選含目的基因的受體細(xì)胞，E正確；

F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端，F錯(cuò)誤；

故選ACE；

【3】雜合子的基因型為Dd，其中D基因片段有兩個(gè)SmaⅠ酶切位點(diǎn)，完全切割后出現(xiàn)三個(gè)片段長(zhǎng)度分別是537bp、790bp、661bp，發(fā)生基因突變后的d基因片段只有一個(gè)SmaⅠ酶切位點(diǎn)，完全切割后出現(xiàn)兩個(gè)片段長(zhǎng)度分別是1327bp、661bp，所以從雜合子中分離的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成會(huì)4種不同的DNA片段；限制酶MspⅠ在質(zhì)粒上存在一個(gè)酶切位點(diǎn)，而限制酶MboⅠ在質(zhì)粒上存在于兩個(gè)酶切位點(diǎn)，因此同時(shí)用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒，則可得到3個(gè)DNA片段；

【4】分析圖解可知，該基因工程中，最好選擇限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，但是利用該酶切割將會(huì)破壞抗生素A抗性基因，則抗生素B抗性基因?yàn)橹亟M質(zhì)粒中的標(biāo)記基因，在篩選過(guò)程中，首先讓大腸桿菌在含抗生素B的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含抗生素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖4的結(jié)果，則圖4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落，所以選出圖3中有但圖4中對(duì)應(yīng)部位沒(méi)有的菌落進(jìn)行培養(yǎng)，就可以得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，如圖。

【5】根據(jù)題意可知，pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因，因此制備培養(yǎng)基時(shí)需要加入氨芐青霉素進(jìn)行篩選，同時(shí)還需要加入瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑，A物質(zhì)用于鑒定lacZ基因是否被破壞；

故選BCD。

【6】如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達(dá)β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會(huì)被水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成白色菌落，因此其中白色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌。

該題的難點(diǎn)為確定限制酶的識(shí)別序列從而合理的對(duì)目的基因和運(yùn)載體進(jìn)行切割和重組操作，該過(guò)程需要學(xué)生認(rèn)知要保證目的基因的完整性，保證質(zhì)粒上至少一個(gè)標(biāo)記基因的完整性和目的基因與運(yùn)載體的合理連接，考察學(xué)生對(duì)基因工程的綜合掌握情況。